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水洗
固定后水洗(10~20 分钟),通常被很多人所忽视,而水洗不彻底,容易造成脱片和染色不鲜艳。对需做免疫组织化学的组织,更不应当忽视。福尔马林不利于组织块内抗原的保存。
脱水和透明
所谓脱水就是利用脱水剂将组织内的水分置换出来,以利于有机溶剂的渗入,这一过程称为脱水。脱水是否彻底,直接关系到组织是否能充分透明,而脱水过度(原因是组织在纯酒精内时间过久,发生组织质地发生变化)容易造成组织发脆。造成组织发脆的原因还有加温(温度超过35℃)、脱水剂内加有丙酮、浸蜡用的石蜡中二甲苯过多等等。一般我们总认为组织发脆跟高浓度酒精有关,而忽视了与低浓度的酒精关系,其实低浓度的酒精具有强大的穿透力,综合玻片标本,比纯酒精更容易渗透到组织块内部使之脱水,组织如果在低浓度酒精里充分脱水,在高浓度酒精里只需脱去从低浓度到高浓度之间的水份,因此,仅需短时间就可完成,如果这时不缩短纯酒精的时间,便会引起组织发脆;如果脱水时加温,使用丙酮,还可引起组织收缩,并影响免疫组织化学的标记。为了使石蜡浸入到组织块内,必须经过一种既能与脱水剂混合,又能与石蜡相溶的媒介物质,微小昆虫玻片标本,这个过程称透明。目前较好的透明剂是二甲苯。很多人认为二甲苯极容易使组织发脆,这个观点很片面,在常温下,如果不是时间过长(超过24小时以上)二甲苯并不会引起组织过份发脆,相反会使某些组织结构比较质韧的组织:比如子宫肌瘤等相当好),但是当二甲苯温度超过 35℃以后,湛江玻片标本,极易引起组织发脆。所以本人认为,大小标本分开脱水,一般情况下,大标本脱水时间(室温18℃)以80%酒精2 小时、95%酒精(2道)各1个半小时至2 小时、纯酒精(3道)各1个半小时至2 小时,二甲苯(2道)各30-60分钟为宜;小标本脱水时间应相应缩短。脱水时间长短,与室温高低有密切的相关。我们在实践中发现,室温在12~15℃时,可作为一个临界温度范围。当室温高于此温度范围时,组织容易脱水,可适当缩短脱水时间;而室温低于该温度范围时,应适当延长脱水时间(如能保证在一个恒定的温度下为佳)。更换试剂,应以量为基础,定量更换,不能等到切片不好时再去更换。否则,至少会有2~3批组织切片不好。根据我科经验,如试剂用量为500ml,每500个蜡块更换一次为宜。
制作方法
渗蜡
将完成透明步骤的组织块浸入透明剂与石蜡混合液中,不断提高石蜡的比例,直至用石蜡完全置换了组织块中的透明剂,便于今后的包理与切片。 石蜡有液态与固态二种,渗蜡要在恒定温箱(60°c)中进行,以保证石蜡处于液态中。
包理
组织块经石蜡渗透后,其内部间隙已完全被石蜡占据,此时还需要用同种硬度的石蜡包理成蜡块以利于后边的切片,显微镜切片玻片标本,包理可用相同的器具,也可折叠一牛皮纸盒。
将液态石蜡缓缓倒入纸盒中,再用镊子轻轻将浸好蜡的组织块夹入纸盒,浅埋在石蜡内,待石蜡冷却成固态即包埋完毕。 至此,一块组织已完成前处理过程,可以切片,前边的步骤表明看来既无高深的理论,又无复杂的技术,一切看似简单,但一步做不到都会造成整个制片的前功尽弃。
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